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本文關(guān)鍵詞:激光掃描共聚焦顯微鏡,顯微技術(shù)
定位、定量
三維重組
動態(tài)測量
*活細胞或組織內(nèi)游離Ca2+濃度的測量
*活細胞內(nèi)H+濃度( pH值)的測量
*自由基的檢測電動轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網(wǎng)絡公司激光雕刻機
*藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量
應用:細胞膜電位的測量
熒光漂白恢復(FRAP)的測量
籠鎖解籠鎖的測量
熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的測量
其他應用
1.標記細胞器熒光探針
(1)細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細胞
SYTO 活細胞
(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker
Red
(3)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 ¨細胞器的單克隆抗體
(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標記線粒體
(5)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ,可染活細胞,陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細胞中停留時間短
JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光
線粒體膜電位低時為多聚體 490/590 發(fā)紅光
可標記活細胞線粒體,且為檢測線粒體膜電
位較佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 ,
穩(wěn)定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細胞
2、定位、定量
免疫熒光標記(單標、雙標或三 標)的定位、定量.如:細胞膜受體或抗原的分布,
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位
細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位雜交-fitc + PI
熒光原位雜交: 染色體基因定位
單細胞凝膠電泳
GFP的表達
游離Ca2+ 的分布與定量
定位、定量研究中常用熒光探針
1)Amine-Reactive Probes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針,可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等
1)FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
2)TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
3)異硫氰基熒光素 494/518
4)PE 藻紅蛋白 565/578
5)Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
6)cy5 650/690
7)cy3 490/530
(1)細胞膜表面受體
配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)
標記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC
(2)細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白
免役熒光標記: 與抗體耦聯(lián),
直標: 一抗+熒光探針電動轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網(wǎng)絡公司激光雕刻機
間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針
3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發(fā)現(xiàn):60年代,Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren),該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光.然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色,后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白電動轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網(wǎng)絡公司激光雕刻機
GFP, 后經(jīng)研究表明,在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后,水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光,GFP在藍激光的激發(fā)下,產(chǎn)生綠色熒光.將外源基因與GFP DNA
相連, GFP可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達.
GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質(zhì)進行準確定位及動態(tài)觀察
如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細胞, 可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程
GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程:定位與定量測量應注意的問題
定位:1.可以對圖像進行修飾,
2.pinhole 可盡可能的小.
3.確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像
定量:
1.儀器的各個條件必須一致
2.必須用原始圖像進行定量測量
3.Pinhole盡可能的大
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