光學(xué)顯微鏡是利用光學(xué)原理，把人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)信息的光學(xué)儀器。
早在公元前一世紀(jì)，人們就已發(fā)現(xiàn)通過球形透明物體去觀察微小物體時(shí)，可以使其放大成像。后來逐漸對(duì)球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認(rèn)識(shí)。
1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。1610年前后，意大利的伽利略和德國(guó)的開普勒在研究望遠(yuǎn)鏡的同時(shí)，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)，當(dāng)時(shí)的光學(xué)工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進(jìn)。
17世紀(jì)中葉，英國(guó)的胡克和荷蘭的列文胡克，都對(duì)顯微鏡的發(fā)展作出了卓越的貢獻(xiàn)。1665年前后，胡克在顯微鏡中加入粗動(dòng)和微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺(tái)。這些部件經(jīng)過不斷改進(jìn)，成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。
1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡，其中九臺(tái)保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡，在動(dòng)、植物機(jī)體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出的成就。
19世紀(jì)，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)，使顯微鏡觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力大為提高。1827年阿米奇第一個(gè)采用了浸液物鏡。19世紀(jì)70年代，德國(guó)人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。這些都促進(jìn)了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展，并為19世紀(jì)后半葉包括科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和微生物提供了有力的工具。
在顯微鏡本身結(jié)構(gòu)發(fā)展的同時(shí)，顯微觀察技術(shù)也在不斷創(chuàng)新：1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。
古典的光學(xué)顯微鏡只是光學(xué)元件和精密機(jī)械元件的組合，它以人眼作為接收器來觀察放大的像。后來在顯微鏡中加入了攝影裝置，以感光膠片作為可以記錄和存儲(chǔ)的接收器。現(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝象管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器，配以微型電子計(jì)算機(jī)后構(gòu)成完整的圖象信息采集和處理系統(tǒng)。
表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學(xué)透鏡可以使物體放大成像，光學(xué)顯微鏡就是利用這一原理把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。近代的光學(xué)顯微鏡通常采用兩級(jí)放大，分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體位于物鏡的前方，被物鏡作第一級(jí)放大后成一倒立的實(shí)象，然后此實(shí)像再被目鏡作第二級(jí)放大，成一虛象，人眼看到的就是虛像。而顯微鏡的總放大倍率就是物鏡放大倍率和目鏡放大倍率的乘積。放大倍率是指直線尺寸的放大比，而不是面積比。
光學(xué)顯微鏡的組成結(jié)構(gòu)
光學(xué)顯微鏡一般由載物臺(tái)、聚光照明系統(tǒng)、物鏡，目鏡和調(diào)焦機(jī)構(gòu)組成。載物臺(tái)用于承放被觀察的物體。利用調(diào)焦旋鈕可以驅(qū)動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)，使載物臺(tái)作粗調(diào)和微調(diào)的升降運(yùn)動(dòng)，使被觀察物體調(diào)焦清晰成象。它的上層可以在水平面內(nèi)沿作精密移動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，一般都把被觀察的部位調(diào)放到視場(chǎng)中心。
聚光照明系統(tǒng)由燈源和聚光鏡構(gòu)成，聚光鏡的功能是使更多的光能集中到被觀察的部位。照明燈的光譜特性必須與顯微鏡的接收器的工作波段相適應(yīng)。
物鏡位于被觀察物體附近，是實(shí)現(xiàn)第一級(jí)放大的鏡頭。在物鏡轉(zhuǎn)換器上同時(shí)裝著幾個(gè)不同放大倍率的物鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進(jìn)入工作光路，物鏡的放大倍率通常為5～100倍。
物鏡是顯微鏡中對(duì)成象質(zhì)量?jī)?yōu)劣起決定性作用的光學(xué)元件。常用的有能對(duì)兩種顏色的光線校正色差的消色差物鏡；質(zhì)量更高的還有能對(duì)三種色光校正色差的復(fù)消色差物鏡；能保證物鏡的整個(gè)像面為平面，以提高視場(chǎng)邊緣成像質(zhì)量的平像場(chǎng)物鏡。高倍物鏡中多采用浸液物鏡，即在物鏡的下表面和標(biāo)本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體，它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。
目鏡是位于人眼附近實(shí)現(xiàn)第二級(jí)放大的鏡頭，鏡放大倍率通常為5～20倍。按照所能看到的視場(chǎng)大小，目鏡可分為視場(chǎng)較小的普通目鏡，和視場(chǎng)較大的大視場(chǎng)目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。
載物臺(tái)和物鏡兩者必須能沿物鏡光軸方向作相對(duì)運(yùn)動(dòng)以實(shí)現(xiàn)調(diào)焦，獲得清晰的圖像。用高倍物鏡工作時(shí)，容許的調(diào)焦范圍往往小于微米，所以顯微鏡必須具備極為精密的微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)。
顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率，顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的較小間距。分辨率和放大倍率是兩個(gè)不同的但又互有聯(lián)系的概念。
當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時(shí)，顯微鏡不能分清物體的微細(xì)結(jié)構(gòu)，此時(shí)即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個(gè)輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力，應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。
聚光照明系統(tǒng)是對(duì)顯微鏡成像性能有較大影響，但又是易于被使用者忽視的環(huán)節(jié)。它的功能是提供亮度足夠且均勻的物面照明。聚光鏡發(fā)來的光束應(yīng)能保證充滿物鏡孔徑角，否則就不能充分利用物鏡所能達(dá)到的較高分辨率。為此目的，在聚光鏡中設(shè)有類似照相物鏡中的 ，可以調(diào)節(jié)開孔大小的可變孔徑光闌，用來調(diào)節(jié)照明光束孔徑，以與物鏡孔徑角匹配。
改變照明方式，可以獲得亮背景上的暗物點(diǎn)(稱亮視場(chǎng)照明)或暗背景上的亮物點(diǎn)(稱暗視場(chǎng)照明)等不同的觀察方式，以便在不同情況下更好地發(fā)現(xiàn)和觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)。
光學(xué)顯微鏡的分類
光學(xué)顯微鏡有多種分類方法：按使用目鏡的數(shù)目可分為雙目和單目顯微鏡；按圖像是否有立體
感可分為立體視覺和非立體視覺顯微鏡；按觀察對(duì)像可分為生物和金相顯微鏡等；按光學(xué)原理可分為偏光，相襯和微差干涉對(duì)比顯微鏡等；按光源類型可分為普通光、熒光、紅外光和激光顯微鏡等；按接收器類型可分為目視、攝影和電視顯微鏡等。常用的顯微鏡有雙目體視顯微鏡、金相顯微鏡、偏光顯微鏡、紫外熒光顯微鏡等。
雙目體視顯微鏡是利用雙通道光路，為左右兩眼提供一個(gè)具有立體感的圖像。它實(shí)質(zhì)上是兩個(gè)單鏡筒顯微鏡并列放置，兩個(gè)鏡筒的光軸構(gòu)成相當(dāng)于人們用雙目觀察一個(gè)物體時(shí)所形成的視角，以此形成三維空間的立體視覺圖像。雙目體視顯微鏡在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛用于切片操作和顯微外科手術(shù)；在工業(yè)中用于微小零件和集成電路的觀測(cè)、裝配、檢查等工作。
金相顯微鏡是專門用于觀察金屬和礦物等不透明物體金相組織的顯微鏡。這些不透明物體無法在普通的透射光顯微鏡中觀察，故金相和普通顯微鏡的主要差別在于前者以反射光，而后者以透射光照明。在金相顯微鏡中照明光束從物鏡方向射到被觀察物體表面，被物面反射后再返回物鏡成像。這種反射照明方式也廣泛用于集成電路硅片的檢測(cè)工作。
紫外熒光顯微鏡是用紫外光激發(fā)熒光來進(jìn)行觀察的顯微鏡。某些標(biāo)本在可見光中覺察不到結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，但經(jīng)過染色處理，以紫外光照射時(shí)可因熒光作用而發(fā)射可見光，形成可見的圖像。這類顯微鏡常用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中。
電視顯微鏡和電荷耦合器顯微鏡是以電視攝像靶或電荷耦合器作為接收元件的顯微鏡。在顯微鏡的實(shí)像面處裝入電視攝像靶或電荷耦合器取代人眼作為接收器，通過這些光電器件把光學(xué)圖像轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的圖像，然后對(duì)之進(jìn)行尺寸檢測(cè)、顆粒計(jì)數(shù)等工作。這類顯微鏡的 可以與計(jì)算機(jī)聯(lián)用，這便于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)和信息處理的自動(dòng)化，多應(yīng)用于需要進(jìn)行大量繁瑣檢測(cè)工作的場(chǎng)合。
掃描顯微鏡是成像光束能相對(duì)于物面作掃描運(yùn)動(dòng)的顯微鏡 。在掃描顯微鏡中依靠縮小視場(chǎng)來保證物鏡達(dá)到較高的分辨率，同時(shí)用光學(xué)或機(jī)械掃描的方法，使成像光束相對(duì)于物面在較大視場(chǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，并用信息處理技術(shù)來獲得合成的大面積圖像信息。這類顯微鏡適用于需要高分辨率的大視場(chǎng)圖像的觀測(cè)。粗準(zhǔn)焦螺旋：大范圍上下調(diào)動(dòng)鏡筒。
細(xì)準(zhǔn)焦螺旋：小范圍上下調(diào)動(dòng)鏡筒。
另外
顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，已有300多年的發(fā)展史。自從有了顯微鏡，人們看到了過去看不到的許多微小生物和構(gòu)成生物的基本單元——細(xì)胞。目前，不僅有能放大千余倍的光學(xué)顯微鏡，而且有放大幾十萬(wàn)倍的電子顯微鏡，使我們對(duì)生物體的生命活動(dòng)規(guī)律有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。在普通中學(xué)生物教學(xué)大綱中規(guī)定的實(shí)驗(yàn)中，大部分要通過顯微鏡來完成，因此，顯微鏡性能的好壞是做好觀察實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。
一、顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)
顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)主要包括物鏡、目鏡、反光鏡和聚光器四個(gè)部件。廣義的說也包括照明光源、濾光器、蓋玻片和載玻片等。
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物鏡是決定顯微鏡性能的較重要部件，安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上，接近被觀察的物體，故叫做物鏡或接物鏡。
1、物鏡的分類
物鏡根據(jù)使用條件的不同可分為干燥物鏡和浸液物鏡；其中浸液物鏡又可分為水浸物鏡和油浸物鏡（常用放大倍數(shù)為90—100倍）。
根據(jù)放大倍數(shù)的不同可分為 低倍物鏡（10倍以下）、中倍物鏡（20倍左右）高倍物鏡（40—65倍）。
根據(jù)像差矯正情況，分為消色差物鏡（常用，能矯正光譜中兩種色光的色差的物鏡）和復(fù)色差物鏡（能矯正光譜中三種色光的色差的物鏡，價(jià)格貴，使用少）。
2、物鏡的主要參數(shù)：
物鏡主要參數(shù)包括：放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和工作距離。
�、佟⒎糯蟊稊�(shù)是指眼睛看到像的大小與對(duì)應(yīng)標(biāo)本大小的比值。它指的是長(zhǎng)度的比值而不是面積的比值。例：放大倍數(shù)為100×，指的是長(zhǎng)度是1μm的標(biāo)本，放大后像的長(zhǎng)度是100μm，要是以面積計(jì)算，則放大了10,000倍。
顯微鏡的總放大倍數(shù)等于物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。
②、數(shù)值孔徑也叫鏡口率，簡(jiǎn)寫NA 或A，是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，與顯微鏡的分辨力成正比。干燥物鏡的數(shù)值孔徑為0.05-0.95，油浸物鏡（香柏油）的數(shù)值孔徑為1.25。
③、工作距離是指當(dāng)所觀察的標(biāo)本較清楚時(shí)物鏡的前端透鏡下面到標(biāo)本的蓋玻片上面的距離。物鏡的工作距離與物鏡的焦距有關(guān)，物鏡的焦距越長(zhǎng)，放大倍數(shù)越低，其工作距離越長(zhǎng)。例：10倍物鏡上標(biāo)有10/0.25和160/0.17，其中10為物鏡的放大倍數(shù)；0.25為數(shù)值孔徑；160為鏡筒長(zhǎng)度（單位mm）；0.17為蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度（單位 mm）。10倍物鏡有效工作距離為6.5mm，40倍物鏡有效工作距離為0.48mm 。
3、物鏡的作用是將標(biāo)本作第一次放大，它是決定顯微鏡性能的較重要的部件——分辨力的高低。
分辨力也叫分辨率或分辨本領(lǐng)。分辨力的大小是用分辨距離（所能分辨開的兩個(gè)物點(diǎn)間的較小距離）的數(shù)值來表示的。在明視距離（25cm）之處，正常人眼所能看清相距0.073mm的兩個(gè)物點(diǎn)，這個(gè)0.073mm的數(shù)值，即為正常人眼的分辨距離。顯微鏡的分辨距離越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。
顯微鏡的分辨力的大小由物鏡的分辨力來決定的，而物鏡的分辨力又是由它的數(shù)值孔徑和照明光線的波長(zhǎng)決定的。
當(dāng)用普通的中央照明法（使光線均勻地透過標(biāo)本的明視照明法）時(shí)，顯微鏡的分辨距離為d=0.61λ/NA
式中d——物鏡的分辨距離，單位 nm。
λ——照明光線波長(zhǎng)，單位 nm。
NA ——物鏡的數(shù)值孔徑
例如油浸物鏡的數(shù)值孔徑為1.25，可見光波長(zhǎng)范圍為400—700nm ，取其平均波長(zhǎng)550 nm，則d=270 nm，約等于照明光線波長(zhǎng)一半。一般地，用可見光照明的顯微鏡分辨力的極限是0.2μm。
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因?yàn)樗拷^察者的眼睛，因此也叫接目鏡。安裝在鏡筒的上端。
1、目鏡的結(jié)構(gòu)
通常目鏡由上下兩組透鏡組成，上面的透鏡叫做接目透鏡，下面的透鏡叫做會(huì)聚透鏡或場(chǎng)鏡。上下透鏡之間或場(chǎng)鏡下面裝有一個(gè)光闌（它的大小決定了視場(chǎng)的大小），因?yàn)闃?biāo)本正好在光闌面上成像，可在這個(gè)光闌上粘一小段毛發(fā)作為指針，用來指示某個(gè)特點(diǎn)的目標(biāo)。也可在其上面放置目鏡測(cè)微尺，用來測(cè)量所觀察標(biāo)本的大小。
目鏡的長(zhǎng)度越短，放大倍數(shù)越大（因目鏡的放大倍數(shù)與目鏡的焦距成反比）。
2、目鏡的作用
是將已被物鏡放大的，分辨清晰的實(shí)像進(jìn)一步放大，達(dá)到人眼能容易分辨清楚的程度。
常用目鏡的放大倍數(shù)為5—16倍。
3、目鏡與物鏡的關(guān)系
物鏡已經(jīng)分辨清楚的細(xì)微結(jié)構(gòu)，假如沒有經(jīng)過目鏡的再放大，達(dá)不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物鏡所不能分辨的細(xì)微結(jié)構(gòu)，雖然經(jīng)過高倍目鏡的再放大，也還是看不清楚，所以目鏡只能起放大作用，不會(huì)提高顯微鏡的分辨率。有時(shí)雖然物鏡能分辨開兩個(gè)靠得很近的物點(diǎn)，但由于這兩個(gè)物點(diǎn)的像的距離小于眼睛的分辨距離，還是無法看清。所以，目鏡和物鏡即相互聯(lián)系，又彼此制約。
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聚光器也叫集光器。位于標(biāo)本下方的聚光器支架上。它主要由聚光鏡和可變光闌組成。其中，聚光鏡可分為明視場(chǎng)聚光鏡（普通顯微鏡配置）和暗視場(chǎng)聚光鏡。
1、光鏡的主要參數(shù)
數(shù)值孔徑（NA ）是聚光鏡的主要參數(shù)，較大數(shù)值孔徑一般是1.2—1.4，數(shù)值孔徑有一定的可變范圍，通�？淘谏戏酵哥R邊框上的數(shù)字是代表較大的數(shù)值孔徑，通過調(diào)節(jié)下部可變光闌的開放程度，可得到此數(shù)字以下的各種不同的數(shù)值孔徑，以適應(yīng)不同物鏡的需要。有的聚光鏡由幾組透鏡組成，較上面的一組透鏡可以卸掉或移出光路，使聚光鏡的數(shù)值孔徑變小，以適應(yīng)低倍物鏡觀察時(shí)的照明。
2、聚光鏡的作用
聚光鏡的作用相當(dāng)于凸透鏡，起會(huì)聚光線的作用，以增強(qiáng)標(biāo)本的照明。一般地把聚光鏡的聚光焦點(diǎn)設(shè)計(jì)在它上端透鏡平面上方約1.25mm處。（聚光焦點(diǎn)正在所要觀察的標(biāo)本上，載玻片的厚度為1.1mm左右）
3、可變光闌
可變光闌也叫光圈，位于聚光鏡的下方，由十幾張金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。其作用是調(diào)節(jié)光強(qiáng)度和使聚光鏡的數(shù)值孔徑與物鏡的數(shù)值孔徑相適應(yīng)�？勺児怅@開得越大，數(shù)值孔徑越大（觀察完畢后，應(yīng)將光圈調(diào)至較大）。
在可變光闌下面，還有一個(gè)圓形的濾光片托架。
說明：在中學(xué)實(shí)驗(yàn)室只有教師用顯微鏡（1600×或1500×）才配有聚光器，學(xué)生用顯微鏡（640×或500×）配的是旋轉(zhuǎn)光欄。緊貼在載物臺(tái)下，能做圓周轉(zhuǎn)動(dòng)的圓盤，旋轉(zhuǎn)光欄（也稱為遮光器），光欄上有大小不等的圓孔，叫光圈。直徑分別為2、3、6、12、16mm,轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)光欄，光欄上每個(gè)光圈都可以對(duì)正通光孔，通過大小不等的光圈來調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。
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反光鏡是一個(gè)可以隨意轉(zhuǎn)動(dòng)的雙面鏡，直徑為50mm，一面為平面，一面為凹面，其作用是將從任何方向射來的光線經(jīng)通光孔反射上來。平面鏡反射光線的能力較弱，是在光線較強(qiáng)時(shí)使用，凹面鏡反射光線的能力較強(qiáng)，是在光線較弱時(shí)使用。
反光鏡通常一面是平面鏡，另一面是凹面鏡，裝在聚光器下面，可以在水平與垂直兩個(gè)方向上任意旋轉(zhuǎn)。
反光鏡的作用是使由光源發(fā)出的光線或天然光射向聚光器。當(dāng)用聚光器時(shí)一般用平面鏡，不用時(shí)用凹面鏡；當(dāng)光線強(qiáng)時(shí)用平面鏡，弱時(shí)用凹面鏡。
觀察完畢后，應(yīng)將反光鏡垂直放置。
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顯微鏡的照明可以用天然光源或人工光源
1、天然光源
光線來自天空，較好是由白云反射來的。不可利用直接照來的太陽(yáng)光。
2、人工光源
�、�、對(duì)人工光源的基本要求：有足夠的發(fā)光強(qiáng)度；光源發(fā)熱不能過多。
�、�、常用的人工光源：顯微鏡燈；日光燈
�。V光器
安裝在光源和聚光器之間。作用是讓所選擇的某一波段的光線通過，而吸收掉其他的光線，即為了改變光線的光譜成分或削弱光的強(qiáng)度。分為兩大類：濾光片和液體濾光器。
�。ㄆ撸┥w玻片和載玻片
蓋玻片和載玻片的表面應(yīng)相當(dāng)平坦，無氣泡，無劃痕。較好選用無色，透明度好的，使用前應(yīng)洗凈。
蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是0.17±0.02mm，如不用蓋玻片或蓋玻片厚度不合適，都回影響成像質(zhì)量。
載玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度是1.1±0.04mm，一般可用范圍是1—1.2mm，若太厚會(huì)影響聚光器效能，太薄則容易破裂。
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